二氢杨梅素磷脂复合物纳米结构脂质载体的制备、表征及药动学研究

摘要：目的制备二氢杨梅素（DMY）磷脂复合物（DMY-PC）和二氢杨梅素磷脂复合物纳米结构脂质载体（DMY-PC-NLC），并分别进行体内外评价。方法溶剂挥发法制备DMY-PC，高压均质法制备DMY-PC-NLC。采用正交试验优化DMY-PC-NLC处方中固液脂质比例，固液脂质材料总用量，DMY-PC投药量和泊洛沙姆188用量，得出DMY-PC-NLC最佳制备处方。5%甘露醇为冻干保护剂进一步将DMY-PC-NLC制备成冻干粉末，并比较DMY-PC和DMY-PC-NLC体外释放和体内药动学行为。结果DMY在DMY-PC中以无定形状态存在，1H-NMR显示DMY化学结构未发生改变。正交试验确定DMY-PC-NLC的最佳处方为固液脂质比例为5∶1，固液脂质材料总用量为325 mg，DMY-PC投药量为45 mg，泊洛沙姆188用量为0.9%。DMY-PC-NLC平均粒径为（197.25±4.42）nm，Zeta电位为（−18.2±2.1）mV，包封率为（71.68±1.36）%，载药量为（3.94±0.24）%。DMY-PC-NLC体外释药模型符合Weibull模型，方程为lnln(1－Mt/M∞)＝0.700 1 lnt－1.954 1（r＝0.971 4）。与DMY原料药相比，DMY-PC相对生物利用度提高至1.63倍，而DMY-PC-NLC提高至3.22倍。结论与DMY-PC相比，DMY-PC-NLC进一步促进了DMY的体内吸收，有效提高了DMY口服吸收生物利用度。

二氢杨梅素（dihydromyricetin，DMY）主要存在于蛇葡萄科葡萄属植物中，属于二氢黄酮类化合物。现代药理学研究表明，DMY具有抗炎、降压、降血糖及治疗脂肪性肝炎等活性[1-3]。近年来随着对DMY抗肿瘤活性的深入研究，发现DMY对乳腺癌、肝癌、鼻咽癌、肺癌等多种肿瘤细胞的增殖具有较强的抑制作用。抗肿瘤作用机制包括诱导肿瘤细胞周期阻滞、抑制肿瘤血管生成及抑制肿瘤侵袭和转移等[4]，因此非常有希望开发成为一种中药抗肿瘤药物。但DMY溶解度较差[5]，体内吸收困难，导致生物利用度较低[6]。目前已有DMY包合物、微乳、脂质体及纳米胶束等制剂学研究[7-8]。

纳米结构脂质载体（nanostructured lipid carriers，NLC）系采用固态和液态混合脂质为载体而制备的一种纳米给药系统[9-12]，与固体脂质纳米粒相比，具有相对较高的载药量和制剂稳定性等优势。但中药活性成分的亲脂性对NLC包封率影响较大，合适的亲脂性可提高包封率[13-14]。磷脂复合物（phospholipids complex，PC）在改善中药活性成分脂溶性方面已获得制剂研究者的公认[15-19]，但PC具有较强的疏水性，体外溶出受限。本研究首先将DMY制备二氢杨梅素-磷脂复合物（DMY-PC），并对制备的DMY-PC进行表征。进一步将DMY-PC制备成DMY-PC-纳米结构脂质载体（DMY-PC-NLC），正交试验优化得出最佳处方，并对DMY-PC-NLC进行体外和体内药动学评价。期望为DMY制剂的开发、研究提供有价值的借鉴。

1材料与仪器

1.1材料与试剂

DMY原料药，批号P20151015，质量分数99.0%，上海爱启医药技术有限公司；磷脂酰胆碱，批号PC-98T，质量分数＞85%，上海艾韦拓医药科技有限公司；芹菜素对照品，批号P0587，质量分数99.4%，成都瑞芬思生物科技有限公司；单硬脂酸甘油酯、泊洛沙姆188，国药集团化学试剂有限公司；氘代甲醇（CD3OD），美国Sigma公司；肝素，批号160507，南京新百药业有限公司；其他试剂为分析纯。

1.2仪器

BP 210D型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；1200型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；R2000型旋转蒸发仪，艾卡仪器设备有限公司；400 MHz ADV III型核磁共振仪，Topspin 3.2试验控制及数据处理软件，瑞士Bruker公司；GJB300-100型均质机，常州均质机械有限公司；ZRS-8型智能溶出试验仪，天津大学无线电厂；Nanosep®超滤离心管，截留相对分子质量10 000，美国PALL公司；Nano ZS90型纳米粒度仪，英国Malvern公司；HX-10-50D型冻干机，上海沪析冷冻干燥机设备公司；MD200-2型氮气吹扫仪，杭州奥威仪器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱，上海跃进医疗器械厂。

1.3动物

清洁级SD大鼠，体质量约为300 g，雌雄兼用，河南省实验动物中心，动物使用许可证号SCXK（豫）2016-0002。

2方法与结果

2.1 DMY-PC的制备及纯化

按照物质的量比为1∶1.2，分别称取DMY和磷脂酰胆碱适量置于三角烧瓶中，加入四氢呋喃100 mL。50℃水浴中磁力搅拌3 h至溶液澄清，于40℃减压旋干，收集残留物即得DMY-PC粗品。由于DMY难溶于石油醚，而DMY-PC在石油醚中溶解度较好，DMY-PC粗品具体纯化过程为石油醚加入到DMY-PC粗品中，采用0.22μm微孔滤膜过滤出去游离的DMY。滤液经减压旋蒸后收集残留物即得纯DMY-PC，密封保存。物理混合物按同比例简单物理混合。

2.2 DMY-PC表征

2.2.1 DMY-PC存在状态研究采用XRPD分别对DMY、磷脂酰胆碱、物理混合物和DMY-PC进行扫描。扫描条件为铜靶，管压40 kV，管流200 mA，扫描范围3°～45°，扫描速度5°/min。结果见图1，DMY的XRPD图谱呈现典型的晶型特征，DMY与磷脂酰胆碱制备的物理混合物中仍显现DMY的特征晶型峰，说明简单的混合不改变DMY的存在状态。而DMY-PC的XRPD图谱呈现典型的无定形特征，说明DMY-PC是不同于物理混合物的一种物质。

2.2.2 DMY-PC氢核磁共振（1H-NMR）研究DMY结构式中含有5个酚羟基（图2），选用CD3OD作为氘代溶剂时，化学位移δ3.33处为溶剂峰，δ4.78处为水峰。由于CD3OD的质子交换作用，使DMY结构中的5个酚羟基在氢谱中消失。DMY的1H-NMR及其他4处峰归属分别见图3和表1。将DMY制备成DMY-PC后，DMY的5处质子峰在DMY-PC的1H-NMR图谱中仍可观察到，且化学位移及峰型均未发生变化，说明DMY与磷脂酰胆碱之间未发生化学反应。在DMY-PC中DMY仍保持自身的化学结构，这与相关研究观察到的现象一致[20]，但DMY在DMY-PC中峰强度明显变弱。

2.3 DMY-PC-NLC的制备

按处方量称取DMY-PC、单硬脂酸甘油酯和中链甘油三酯置于圆底烧瓶，75℃水浴加热熔融后作为混合油相。另称取适量泊洛沙姆188溶解于50 mL蒸馏水中，并加热至75℃后作为水相。设置搅拌速度为1 000 r/min，将混合油相逐滴滴加至水相中制备初乳。装有初乳的圆底烧瓶置于冰水混合物中，于均质压力为60 MPa的条件下，循环高压均质8次，即得DMY-PC-NLC。空白NLC采用磷脂酰胆碱代替DMY-PC同法制备。

2.4 DMY含量分析

2.4.1色谱条件色谱柱为Waters C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液（45∶55）；柱温35℃；检测波长291 nm；体积流量1.0 mL/min；进样体积20μL。理论塔板数以DMY计不低于8 000。典型色谱图见图4。

2.4.2线性关系考察精密称取DMY对照品25 mg，溶解于50 mL乙腈即得0.5 mg/mL的DMY对照品储备液。采用乙腈-0.1%磷酸水溶液（45∶55）逐步稀释到质量浓度为25、12.5、5、0.5、0.05μg/mL对照品溶液，进行HPLC测定，以各质量浓度的峰面积（A）对质量浓度（C）进行线性回归，得标准曲线方程A＝0.100 8 C＋0.968 9 5，r＝0.999 9。

2.4.3供试品溶液的制备取1.0 mL DMY-PC-NLC置于50 mL量瓶中，加入约30 mL乙腈超声3 min后放置至室温，乙腈-0.1%磷酸水溶液（45∶55）定容即得供试品溶液。

2.4.4方法学研究分别取25、12.5、0.05μg/mL的DMY对照品溶液，分别连续进样6次，并计算其RSD值。结果显示，DMY峰面积RSD值分别为0.19%、0.24%、0.37%。取供试品溶液，于0、2、4、6、12、24、48 h时间点分别进样测定DMY峰面积，计算其RSD值为1.17%。取DMY-PC-NLC，按照“2.4.3”项方法配制供试品溶液6份，按照“2.4.1”项色谱条件分别进行HPLC测定，计算其RSD值。结果显示6批DMY-PC-NLC的RSD值为1.43%，说明分析方法的重复性良好。取9份1.0 mL空白NLC混悬液置于50 mL的量瓶中，分别加入高（20.0μg/mL）、中（12.5μg/mL）、低（5.0μg/mL）的DMY对照品溶液，每种质量浓度分别配制3份，加入约30 mL乙腈超声3 min后放置至室温，乙腈-0.1%磷酸水溶液（45∶55）定容，分别进行HPLC测定DMY含量，并计算回收率。结果显示回收率在98.83%～99.56%，3种质量浓度的RSD值均小于1.51%。

2.5包封率及载药量的测定

取1.0 mL DMY-PC-NLC加入到超速离心管中，12 000 r/min离心30 min，测定滤液中游离DMY含量（m游离）。另量取1.0 mL DMY-PC-NLC至10 mL量瓶中，乙腈超声并定容，测定DMY总量（m总）。计算DMY-PC-NLC的包封率和载药量。

包封率＝(m总－m游离)/m总

载药量＝(m总－m游离)/(m总脂质＋m总－m游离)

m总表示DMY总量，m游离表示游离DMY含量，m总脂质表示DMY-PC-NLC固态和液态脂质总量

2.6正交试验优化DMY-PC-NLC制备工艺

正交试验优化以包封率为评价指标。根据预试验，选择脂质材料总用量（A）、固液脂质材料比例（B）、DMY-PC的投药量（C）和泊洛沙姆188的质量分数（D），设计4因素3水平的L9(34)正交设计表。因素水平和结果见表2，4因素的方差分析见表3。由表3中极差值可判断出选定的各因素影响大小顺序为A＞B＞C＞D。由各因素均值大小可知最佳处方为A2B1C2D1。即DMY-PC-NLC最佳处方为固液脂质材料总用量为325 mg，固液脂质材料比例为5∶1，DMY-PC投药量为45 mg，泊洛沙姆188的质量分数为0.9%。按照“2.5”项下方法测定3批DMY-PC-NLC的包封率为（71.68±1.36）%，载药量为（3.94±0.24）%。

2.7 DMY-PC-NLC粒径及Zeta电位

取最佳处方制备的DMY-PC-NLC，采用蒸馏水1∶10稀释后，测得平均粒径为（197.25±4.42）nm，聚合物分散系数（polymerdispersion index，PDI）为0.122±0.034，典型图谱见图5。测得Zeta电位为（−18.2±2.1）mV，典型图谱见图6。

2.8 DMY-PC-NLC冻干粉末的制备

取2 mL DMY-PC-NLC置于西林瓶中，加入5%甘露醇，震荡混匀。按照表4冻干程序，混合液经历预冻（−65℃温度保持不变16 h）、升华阶段（4个升温点）和解析阶段（3个升温点）进行冻干，并在52 h后于25℃维持6 h，最终得DMY-PC-NLC冻干粉末。

2.9体外释放及机制研究

取DMY-PC-NLC冻干粉、DMY-PC和DMY原料药（以DMY计，含量40 mg），2 mL蒸馏水制备混悬液，置于透析袋中，两端扎紧。设置溶出仪速度为75 r/min，温度为37℃，溶出介质为900 mL的蒸馏水。分别于0、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、18、24 h时间点取样4 mL，立即补加4 mL蒸馏水。测定取样液中DMY含量，计算各个时间点的药物累积释放率，结果见图7。DMY原料药在4 h内累积释放率达到97.12%。DMY-PC溶出速率较慢，这与DMY-PC疏水性较强、分散性较差有关。DMY-PC-NLC在前期8 h内释药相对较快，累积释放率为45.37%，之后具有明显的缓释特征，在24h内累积释放率为63.73%。分别以零级模型、一级模型、Weibull模型和Higuchi模型对DMY-PC-NLC体外释药行为进行拟合，并以相关系数（r）判断最佳释药模型，结果见表5。DMY-PC-NLC体外释药模型更符合Weibull模型，方程为lnln(1－Mt/M∞)＝0.700 1 lnt－1.954 1，r＝0.971 4，其中，Mt为t时间累积释放率，M∞为∞时累积释放率，Mt/M∞为t时间累积释放率，t为时间。另外，分别以零级模型、一级模型、Weibull模型和Higuchi模型对DMY-PC和原料药体外释药行为进行拟合，DMY-PC体外释药也最符合Weibull模型，方程为lnln(1－Mt/M∞)＝0.689 9 lnt－2.568 3，r＝0.975 6；DMY原料药在前4 h内释药模型更符合一级释药模型，方程为ln(1－Mt/M∞）＝−0.715 3 t＋0.064 8，r＝0.989 4。

2.10体内药动学研究

2.10.1给药溶液的配制称取DMY原料药、DMY-PC和DMY-PC-NLC适量，加入体积为3 mL质量分数为0.5%的CMC-Na溶液，配制成50.0 mg/mL的给药混悬液（以DMY含量计）。

2.10.2分组、给药及血样采集取SD大鼠18只，雌雄兼用，随机分为3组。按150 mg/kg剂量（以DMY计）分别ig给予DMY原料药、DMY-PC和DMY-PC-NLC的给药混悬液。于0.083、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12 h时间点，眼眶取血0.3 mL，玻璃毛细管引流至肝素化离心管中，混匀。4 000 r/min离心2 min，分取上层血浆置于冰箱冷冻保存。

2.10.3血浆样品的处理量取正己烷100 mL，二氯甲烷70 mL和异丙醇15 mL，混匀，超声5 min后即得血浆样品的提取溶液。精密吸取解冻后的血浆样品100μL和内标溶液40μL，涡旋混匀后加入4 mL提取溶剂，混匀后涡旋4 min。10 000 r/min离心10 min，小心分取上层有机相，40℃氮气缓慢吹除有机溶剂得残渣。加入100μL的流动相复溶。

2.10.4色谱条件及线性关系考察精密称取10.0 mg的芹菜素对照品溶解于10 mL乙腈，进一步用流动相稀释至1.0μg/mL即得内标溶液。取“2.4.2”项下DMY对照品溶液，大鼠空白血浆配制20、50、100、200、400、800 ng/mL的DMY血浆溶液，按照“2.10.3”项下处理。流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液（40∶60），其他色谱条件同“2.4.1”项下，HPLC法测定DMY各个质量浓度的峰面积和内标的峰面积。DMY与内标峰面积之比（As/Ai）为横坐标，DMY质量浓度（C）为纵坐标进行线性回归后得方程C＝179.864 2 As/Ai－0.48，r＝0.991 4。由r可知，DMY在20～800 ng/mL线性关系良好。

2.10.5方法学考察分别取大鼠空白血浆，血浆对照品及血浆样品。流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液（40∶60），其他色谱条件同“2.4.1”项下色谱条件进行HPLC测定，典型色谱图见图8，血浆内源性物质不干扰DMY和内标色谱峰，专属性较高。其中，DMY约在6.1 min处出峰，内标在7.08 min处出峰。取20、400、800 ng/mL的DMY血浆溶液，分别作为低、中、高质量浓度。各质量浓度连续进样6次后计算低、中、高质量浓度血浆样品的RSD值分别为13.62%、10.83%、6.12%。6 d内分别进行测定，计算低、中、高质量浓度血浆样品的RSD值分别为12.55%、6.89%、7.93%。取DMY-PC-NLC给药0.5 h的血浆样品，分别于12 h内测定DMY与内标峰面积比值，计算得RSD值1.87%。大鼠空白血浆分别配制低（20 ng/mL）、中（400 ng/mL）、高（800 ng/mL）质量浓度，进行HPLC测定，将测得的峰面积带入方程得测定质量浓度，并与配制质量浓度进行对比得出回收率。实验表明低、中、高质量浓度回收率在86.49%～102.67%。取DMY血浆对照品进行逐步稀释，结果显示定量限（S/N＝10）为20 ng/mL，检测限（S/N＝3）为10 ng/mL。综合方法学考察结果，建立的HPLC方法和血浆处理方法可用于DMY血浆样品分析。

2.10.6药动学结果药-时曲线见图9。主要药动学参数采用3P97软件进行数据处理，拟合的DMY在大鼠体内药动过程均符合二室模型。AUC和Cmax经对数转换后采用独立样本t检验，t1/2和tmax采用非参数法秩和检验，结果见表6。与DMY相比，DMY-PC的AUC0~t和AUC0~∞差异均具有显著性（P＜0.05），而tmax、Cmax和t1/2等参数差异无显著性（P＞0.05）。DMY-PC进一步制备成DMY-PC-NLC后，tmax、Cmax、t1/2、AUC0~t和AUC0~∞等药动学参数均有显著变化（P＜0.05、0.01），说明DMY-PC-NLC极大改变了DMY在体内的药动学行为。DMY-PC-NL与DMY-PC相比，tmax、Cmax、t1/2、AUC0~t和AUC0~∞等药动学参数也具有统计学意义（P＜0.05、0.01），说明DMY-PC-NLC可进一步促进DMY-PC体内吸收。清除率（CL）均下降，其中DMY-PC-NL的CL与DMY或DMY-PC相比差异具有显著性（P＜0.05、0.01），体内循环时间延长。与DMY相比，DMY-PC相对生物利用度提高至1.63倍，而DMY-PC-NLC提高至3.22倍。

3讨论

超速离心法测定包封率时，具有操作简单，费用较少等优势。但前期研究发现，当转速达到20 000 r/min时，通过采用纳米粒度仪测定上清液，发现仍有纳米粒子存在，表明高速离心法并不能使DMY-PC-NLC完全沉淀。采用葡聚糖凝胶柱法测定包封率时，出现回收率较低或洗脱过程葡聚糖凝胶塌陷现象，因此也不合适。超滤法是在离心力的作用下，利用筛分原理对相对分子质量较大的溶质或纳米粒进行截留，从而实现有效分离。采用纳米粒度仪测定超滤法滤液时，未能检测到纳米粒，说明超滤离心管可以截留DMY-PC-NLC，因而最终选用超滤法测定包封率及载药量[21]。

磷脂酰胆碱分子由2条自由移动的非极性尾部和极性头部构成，其中2条尾部含有非饱和的双键及饱和的脂肪酸链。有报道认为[16]，药物与磷脂酰胆碱形成磷脂复合物时，自由移动的的非极性尾部包裹了药物分子，使药物分子与磷脂酰胆碱极性端定向结合，使药物分子高度分散在磷脂酰胆碱中，各自的晶型特征被抑制，从而表现出无定型状态。磷脂酰胆碱中磷原子上羟基的氧原子有得电子能力，而氮原子有失电子能力，可与药物分子之间以氢键或范德华力结合在一起，但并不能形成新的化合物，因而在1H-NMR图谱上认可观察到DMY的各个基团峰，但峰强度发生明显下降。

PC技术可改善难溶性药物的脂溶性，但PC分散性很差，导致体外溶出速率较慢。本研究将DMY-PC制备成DMY-PC-NLC后，极大提高了分散性。同时由于NLC的包裹保护作用，使DMY-PC免受水相环境、酶等因素对其破坏，也有助于提高DMY-PC的稳定性，为进一步提高生物利用度奠定了基础。因此，不同制剂新技术的联用可以弥补单种制剂技术的某种不足。

药动学研究结果显示，DMY-PC-NLC的tmax、Cmax、t1/2、AUC0~t和AUC0~∞等药动学参数与DMY-PC相比具有统计学意义（P＜0.05、0.01），说明DMY-PC-NLC可进一步促进DMY-PC体内吸收。课题组前期将本处方中物理混合物代替DMY-PC，其他处方及制备工艺均保持不变，制备DMY-NLC。测定DMY-NLC包封率为（58.79±1.70）%，低于DMY-PC-NLC的包封率（71.68±1.36）%。这可能与DMY-PC改善了DMY的脂溶性有关，使更多的药物被包裹进NLC中，再次体现出不同制剂技术联用的必要性。

本实验中用到的磷脂酰胆碱除了改善DMY亲脂性，提高包封率，还可与泊洛沙姆188发生协同作用，对DMY-PC-NLC的粒径分布均匀及制剂稳定性的提高也有一定益处[22]。与DMY相比，DMY-PC-NLC的生物利用度提高至3.22倍。NLC由于较小的粒径可增加与胃肠道黏膜的接触面积，有助于增加药物吸收；同时DMY-PC-NLC中的磷脂及非离子表面活性剂泊洛沙姆188可提高胃肠道黏膜的通透性、增加药物在胃肠道的滞留时间等[23-24]，也可促进药物吸收。另外，NLC可在淋巴结构Peyer’s parches中聚集，经M细胞吸收进入体循环[25-28]，最终极大提高了DMY的生物利用度。本研究证明了DMY-PC与NLC联用的必要性及可行性，接下来研究重点放在DMY-PC-NLC的药效学评价上，为DMY-PC-NLC提供更为全面的研究资料。