迷迭香的化学成分、活性研究方法

摘要：目的研究迷迭香Rosmarinus officinalis的化学成分及其活性。方法采用多种柱色谱对迷迭香地上部分甲醇提取物进行分离纯化；通过波谱数据对化合物进行结构鉴定；采用磺酰罗丹明B比色法（SRB法）对所得化合物进行细胞毒活性测试。结果从迷迭香的甲醇提取物中分离得到2个新的松香烷型二萜类化合物和8个已知二萜类化合物，分别鉴定为7-异丙氧基-表异迷迭香酚（1）、7-异丙氧基-迷迭香醌（2）、迷迭香酚（3）、7-甲氧基-迷迭香酚（4）、表迷迭香酚（5）、7-甲氧基-表异迷迭香酚（6）、rosmaquinone B（7）、鼠尾草酚（8）、galdosol（9）和pisiferal（10）。结论化合物1和2为新化合物，分别命名为7-异丙氧基-表异迷迭香酚和7-异丙氧基-迷迭香醌。活性测试结果表明所有二萜类化合物均无明显细胞毒活性。

迷迭香Rosmarinus officinalis Linn.为唇形科多年生常绿亚灌木，原产欧洲，目前在我国南方广西、云南、贵州等地均有种植。迷迭香作为一种传统香料广泛应用于食品加工、食用香料、化妆品、保健品等行业[1]，在医疗保健方面也已被研究证实具有抗肿瘤[2-3]、免疫调节[4]、抗炎[5]、保护肝功能[6]、治疗心血管疾病[7]等多种作用。

到目前为止，迷迭香中已经分离并鉴定的化学成分主要是黄酮类[8-13]、萜类[14-15]、有机酸[16]和挥发油[17]等，本实验从迷迭香地上部分甲醇提取物中分离得到10个二萜类化合物，分别鉴定为7-异丙氧基-表异迷迭香酚（7-O-isopropyl-epirosmanol，1）、7-异丙氧基-迷迭香醌（7-O-isopropyl rosmaquinone，2）、迷迭香酚（rosmanol，3）、7-甲氧基-迷迭香酚（7-O-methyl-rosmanol，4）、表迷迭香酚（epirosmanol，5）、7-甲氧基-表异迷迭香酚（7-methoxy-epirosmanol，6）、rosmaquinone B（7）、鼠尾草酚（carnosol，8）、galdosol（9）和pisiferal（10），其中化合物1和2为新的松香烷型二萜，结构见图1。

1仪器与材料

Avence 400核磁共振仪（德国Bruker公司）；LC3000高效液相色谱仪（瑞亿斯公司）；UV-2600紫外光谱仪（日本岛津公司）；Perkin-Elmer 341旋光仪（美国Perkin-Elmer公司）；Nicolet Nexus 470 FT-IR红外光谱仪（美国Thermo公司）；200～300、300～400目柱色谱硅胶（青岛海洋化工厂）；RP18反相硅胶（Merck公司）；MCI树脂（CHP20P，75～150μm，MitsubishiChemical Industries Ltd.，）和Sephadex LH-20凝胶（Pharmacia公司）；薄层色谱硅胶GF254板（安徽良臣硅源材料有限公司）；色谱试剂（中天化工、申试试剂公司）。

迷迭香地上部分，由绿友股份有限公司提供，药材经武汉大学药学院杨升平教授鉴定为唇形科迷迭香属植物迷迭香Rosmarinus officinalis Linn.。

2提取与分离

将干燥的迷迭香地上部分甲醇提取物粉末（500 g）经水混悬后分别用醋酸乙酯、正丁醇萃取，得到不同极性部位。再将醋酸乙酯部位（200 g）过正相硅胶柱色谱，经石油醚-醋酸乙酯梯度洗脱（10∶1～1∶1），得到9个部分A～I。

G部分经正相硅胶柱色谱（氯仿-甲醇50∶1→1∶1）梯度洗脱后，得到6个组分G1～G6，G5再经正相硅胶柱色谱（石油醚-异丙醇40∶1→1∶1）梯度洗脱后，得到G5a～G5f，G5a部分反复结晶得到化合物4（1.178 g），G5d再经正相硅胶柱色谱（石油醚-醋酸乙酯3.5∶1）分离得到化合物9（33 mg）和G5d2，G5d2经HPLC 80%甲醇等度洗脱，得到化合物2（31 mg，tR＝14 min）。G6再经正相硅胶柱色谱（石油醚-醋酸乙酯10∶1→2∶1）分离得到G6a～G6e，G6e再经反相RP18反相色谱分离（甲醇30%→100%），得到G6e1～G6e3，G6e2再经正相硅胶柱色谱（石油醚-异丙醇40∶1）分离得到化合物6（16 mg）。F部分用正相硅胶柱色谱（氯仿-甲醇50∶1→10∶1）梯度洗脱后，得到F1～F3，F3再经正相柱色谱（石油醚-醋酸乙酯-甲酸10∶1∶0.1）分离得到化合物7（156 mg）和8（86 mg）和F3c，F3c经RP18反相色谱分离得到F3c1，F3c1经HPLC 76%甲醇等度洗脱，得到化合物3（61 mg）。E部分经正相硅胶柱色谱（石油醚-异丙醇50∶1→1∶1）梯度洗脱后得到E1～E6，E1经正相硅胶柱色谱（石油醚-醋酸乙酯20∶1）分离后再经HPLC 95%甲醇等度洗脱得到化合物5（32 mg，tR＝18 min），E6再经凝胶柱色谱和RP18反相色谱分离得到化合物10（33 mg）和E6a4，E6a4再经正相硅胶柱色谱（石油醚-异丙醇20∶1）得到化合物1（43 mg）。

3结构鉴定

化合物1：黄色粉末，[α]20D–31.6°(c 0.20，MeOH)。ESI-MS m/z:411.412 1[M＋Na]+（计算值为411.412 7，C23H32O5）。(cm−1):3 469，3 268，1 743，1 622，1 445，1 376，1 011，1 068。(nm):227.5(4.26)，290.0(3.63)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)谱图显示6个芳香碳信号δC 142.3，141.8，135.2，127.1，124.1，120.1，确定了苯环的存在，其中含有1个芳香氢信号δH6.73(1H，s)，推测结构中可能含有五取代苯环。δH 4.56(1H，d，J=3.2 Hz)和4.39(1H，d，J=3.2 Hz)2个氢之间相互偶合，提示是2个连在相邻含氧碳上氢的信号；δH1.01(3H，s)和0.90(3H，s)是2个甲基的信号，而δH 3.98(1H，m)，1.37(3H，d，J=6.0 Hz)，1.27(3H，d，J=6.0 Hz)，3.04(1H，m)，1.20(3H，d，J=3.4 Hz)和1.16(3H，m)提示存在2组连在氧或者苯环上的异丙基信号。将化合物1的1H-NMR和13C-NMR数据与化合物9进行对比，发现化合物1除了比9多1个异丙基信号之外，其他的数据基本相似，由此推断化合物1与9有相似的骨架，鉴于在前期过柱分离过程中使用了异丙醇，因此结构中的异丙基是否为分离过程中产生尚无法验证，但得到的化合物确实为新化合物。

在HMBC光谱（图2）中H-6(δH 4.56)与C-4(δC 31.4)，C-8(δC 127.1)，C-10(δC 47.0)和C-20(δC 179.4)相关，H-7(δH 4.39)与C-5(δC 50.9)，C-9(δC124.1)和C-14(δC 120.1)相关，说明C-5、C-6、C-7、C-8、C-9、C-10 6个碳形成了1个六元环，H-14(δH 6.73)与C-9(δC 124.1)，C-12(δC 141.8)和C-15(δC 27.2)相关，说明C-8、C-9、C-11、C-12、C-13、C-14也形成了1个苯环。H-21(δH 3.98)与C-7(δC 73.5)，C-22(δC23.6)，C-23(δC 22.3)相关，说明结构中存在1个异丙氧基，且其连接在C-7上。综上所述确定了化合物1的平面结构1，3，4，9，10，10a-hexahydro-5，6-dyhydroxy-9-O-isopropyl-1，1-dimethyl-7-(1-methylethyl)-2H-10，4a-(epoxymethano)phenanthren-12-one，为1个新化合物，命名为7-异丙氧基-表异迷迭香酚。H-6和H-7的偶合常数为3.2 Hz，说明H-6和H-7都为α取向，由此确定化合物1的相对构型。化合物1的1H-NMR和13C-NMR谱图数据的归属见表1。

化合物2：棕黄色粉末，[α]20D−172.7°(c 0.04，MeOH)。ESI-MS m/z:409.198 6[M＋Na]+（计算值为409.199 1，C23H30O5）。(cm−1):1 780，1 670，1515，1386。(nm):209.0(4.10)，404.0(3.31)。结合碳谱推导出分子式为C23H30O5。化合物2的1H-NMR的谱图数据与化合物7的数据很相似，说明化合物2与7有相似的骨架。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)中δH 1.35(3H，d，J=6.1 Hz)，1.30(3H，d，J=6.1 Hz)和3.98(1H，m)为异丙基信号。在HMBC光谱（图2）中，H-21(δH 3.98，m)与C-7(δC 73.4)，C-22(δC 23.5)，C-23(δC 22.1)相关，说明结构中存在1个异丙氧基，并且连接在C-7上。综合上述分析，确定了化合物2的平面结构为1，3，4，9，10，10a-hexahydro-9-O-isopropyl-1，1-dimethyl-7-(1-methylethyl)-2H-10，4a-(epoxymethano)phenanthrene-5，6，12-trione，为1个新化合物，命名为7-异丙氧基-迷迭香醌。化合物2中H-6和H-7的偶合常数为3.0 Hz，说明H-6和H-7都为α取向，由此确定化合物2的相对构型。化合物2的1H-NMR和13C-NMR谱图数据的归属见表1。

化合物3：白色片状结晶（甲醇），C20H26O5，1H-NMR(400 MHz，MeOD)δ:6.86(1H，s，H-14)，4.61(1H，d，J=3.2 Hz，H-7)，4.54(1H，d，J=3.2Hz，H-6)，3.24(1H，dt，J=13.7，6.9Hz，H-15)，3.19(1H，s，H-15)，2.28(1H，s，H-5)，1.99(1H，dt，J=14.0，5.3 Hz，H-1b)，1.23(3H，d，J=6.9 Hz，16-CH3)，1.21(3H，d，J=6.9 Hz，17-CH3)，1.04(3H，s，18-CH3)，0.92(3H，s，19-CH3)。以上数据与文献对照一致[18]，故确定化合物3为迷迭香酚。

化合物4：白色粉末，C21H28O5，1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ:6.78(1H，s，H-14)，4.70(1H，d，J=3.0 Hz，H-7)，4.26(1H，d，J=3.0 Hz，H-6)，3.66(3H，s，-OCH3)，3.05(1H，dt，J=13.7，6.9 Hz，H-15)，3.17(1H，d，J=14.2 Hz，H-15)，2.24(1H，s，H-5)，1.99(1H，td，J=13.8，5.5 Hz，H-12)，1.21(3H，d，J=6.9 Hz，16-CH3)，1.21(3H，d，J=6.9 Hz，17-CH3)，1.01(3H，s，18-CH3)，0.92(3H，s，19-CH3)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ:178.1(C-20)，141.2(C-11)，140.9(C-12)，134.0(C-13)，125.6(C-8)，122.9(C-9)，119.4(C-14)，76.4(C-6)，77.6(C-7)，57.2(C-21)，49.8(C-5)，46.1(C-10)，37.0(C-3)，30.5(C-4)，30.3(C-18)，26.2(C-1)，26.1(C-15)，21.5(C-16)，21.1(C-17)，21.0(C-19)，18.0(C-2)。以上数据与文献对照一致[19]，故确定化合物4为7-甲氧基-迷迭香酚。

化合物5：白色粒状结晶（甲醇），C20H26O5，1H-NMR(400 MHz，MeOD)δ:6.91(1H，s，H-14)，4.68(3H，d，J=2.2 Hz，H-6)，4.59(3H，d，J=2.2Hz，H-7)，3.17(1H，dt，J=13.6，6.8Hz，H-15)，1.94(1H，s，H-2)，1.93～1.83(1H，m，H-3)，1.38(1H，d，J=12.9 Hz，H-1)，1.20(1H，d，J=10.3 Hz，H-5)，1.15(3H，d，J=7.4Hz，16-CH3)，1.15(3H，d，J=7.4Hz，17-CH3)，0.97(3H，s，18-CH3)，0.88(3H，s，19-CH3)。以上数据与文献对照一致[20]，故确定化合物5为表迷迭香酚。

化合物6：浅褐色固体粉末，C21H28O5，1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ:6.74(1H，s，H-14)，4.93(1H，d，J=2.2 Hz，H-6)，4.92(1H，d，J=2.4 Hz，H-7)，3.60(3H，s，-OCH3)，3.22(1H，d，J=14.4 Hz，H-1b)，2.97(1H，m，H-15)，1.93(1H，s，H-1a)，1.58(1H，d，J=12.3 Hz，H-2)，1.47(1H，s，H-3)，1.93(3H，s，H-5)，1.11(3H，d，J=6.8 Hz，16-CH3)，0.98(3H，d，J=6.5 Hz，17-CH3)，0.99(3H，s，18-CH3)，0.94(3H，s，19-CH3)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ:179.1(C-20)，143.6(C-11)，141.0(C-12)，136.0(C-13)，126.9(C-8)，122.3(C-9)，118.0(C-14)，78.3(C-6)，74.5(C-7)，56.1(C-21)，55.2(C-5)，47.9(C-10)，37.9(C-3)，31.8(C-4)，31.6(C-18)，27.1(C-1)，26.8(C-15)，22.9(C-16)，22.1(C-17)，22.0(C-19)，18.9(C-2)。以上数据与文献对照一致[21-22]，故确定化合物6为7-甲氧基-表迷迭香酚。

化合物7：白色粉末状固体，C21H26O5，1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ:6.63(1H，s，H-14)，4.64(1H，d，J=2.9 Hz，H-6)，3.88(1H，d，J=3.0 Hz，H-7)，3.68(3H，s，-OCH3)，3.20(1H，d，J=10.9 Hz，H-1b)，2.96～2.86(1H，m，H-15)，1.98(1H，s，H-5)，1.12(3H，d，J=7.0 Hz，16-CH3)，1.10(3H，d，J=7.0 Hz，17-CH3)，1.00(3H，s，18-CH3)，0.89(3H，s，19-CH3)。以上数据与文献对照一致[23]，故确定化合物7为rosmaqunione B。

化合物8：白色粉末状固体，C20H26O4，1H-NMR(400 MHz，pyridine-d6)δ:6.63(1H，s，H-14)，5.41(1H，s，H-7)，3.14～3.02(1H，m，H-15)，2.90(1H，d，J=13.1 Hz，H-1b)，2.40(1H，d，J=4.4 Hz，H-1a)，2.24～2.15(1H，m，H-6a)，1.99(1H，d，J=13.7 Hz，H-2b)，1.92～1.81(1H，m，H-6b)，1.76～1.68(2H，m，H-5)，1.23(3H，s，16-CH3)，1.21(3H，s，17-CH3)，0.89(3H，s，18-CH3)，0.85(3H，s，19-CH3)；13C-NMR(100 MHz，pyridine-d6)δ:178.6(C-20)，147.3(C-11)，147.1(C-12)，137.4(C-13)，134.6(C-8)，125.4(C-9)，113.9(C-14)，80.2(C-7)，51.1(C-10)，47.8(C-5)，43.3(C-3)，36.6(C-4)，33.7(C-18)，32.2(C-6)，32.0(C-1)，29.5(C-15)，25.2(C-16)，25.1(C-17)，21.9(C-19)，21.5(C-2)。以上数据与文献对照一致[24]，故确定化合物8为鼠尾草酚。

化合物9：白色粉末状固体，C20H24O5，1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ:7.61(1H，s，H-14)，4.72(1H，s，H-6)，3.35(1H，d，J=14.7 Hz，H-15)，1.98(1H，d，J=5.1 Hz，H-1a)，1.70(1H，d，J=7.0 Hz，H-2b)，1.52(1H，d，J=7.0 Hz，H-2a)，1.51(1H，d，J=7.0 Hz，H-3b)，1.23(1H，d，J=7.0 Hz，H-3a)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ:189.9(C-7)，179.0(C-20)，152.2(C-11)，143.4(C-12)，135.7(C-13)，128.3(C-8)，120.7(C-9)，119.9(C-14)，81.6(C-6)，60.3(C-5)，49.7(C-10)，37.6(C-3)，32.4(C-4)，31.7(C-18)，27.4(C-1)，27.0(C-15)，22.4(C-16)，22.2(C-17)，22.0(C-19)，18.7(C-2)。以上数据与文献对照一致[25]，故确定化合物9为galdosol。

化合物10：白色粉末状，C20H28O2，1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ:9.89(1H，s，H-20)，6.91(1H，s，H-14)，6.61(1H，s，H-11)，3.22～3.08(1H，m，H-15)，2.99～2.82(1H，m，H-7)，2.15～1.97(1H，m，H-1)，1.75～1.54(1H，m，H-5)，1.50～1.40(2H，m，H-6)，1.25(1H，s，H-3)，1.22(3H，d，J=2.9 Hz，H-16)，1.20(3H，d，J=2.9 Hz，H-17)，0.99(3H，s，H-18)，0.82(3H，s，H-19)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ:202.1(C-20)，152.2(C-12)，134.7(C-13)，132.6(C-9)，130.0(C-8)，127.2(C-14)，113.8(C-11)，53.4(C-10)，51.9(C-5)，41.3(C-3)，33.9(C-4)，32.6(C-1)，31.5(C-18)，30.2(C-7)，26.8(C-15)，22.6(C-17)，22.4(C-16)，20.6(C-19)，19.6(C-6)，18.4(C-2)。以上数据与文献对照一致[26-27]，故确定化合物10为pisiferal。

4生物活性测试

采用SRB法[28]，测试了各化合物对乳腺癌MCF-7和肺癌A549 2种细胞的生长抑制作用（半数抑制浓度IC50＞10μmol/L或无效）。结果表明迷迭香中分离得到的10种化合物对这2种细胞均无细胞毒活性。