建立夏天无HPLC指纹图谱及多指标成分测定方法

摘要：目的建立夏天无HPLC指纹图谱及多指标成分测定方法，为夏天无药材质量标准提升提供科学依据。方法采用HPLC法，Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色谱柱；以乙腈-0.2%冰醋酸溶液（三乙胺调pH 6.0）为流动相，梯度洗脱；体积流量1.0 mL/min；柱温35℃；进样量10μL；检测波长280 nm；建立15批夏天无药材的指纹图谱，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012A版）进行评价，聚类分析和主成分分析将15批药材分为2类，同时测定原阿片碱、黄藤素、荷包牡丹碱和延胡索乙素4种成分的含量。结果建立了夏天无药材的HPLC指纹图谱，共标定了10个共有峰；原阿片碱、黄藤素、荷包牡丹碱和延胡索乙素线性关系良好，r均大于0.999 9，平均回收率分别为97.12%、100.09%、98.53%、99.71%。结论HPLC指纹图谱结合多指标成分测定可为夏天无药材质量评价提供参考。

夏天无为罂粟科植物伏生紫堇Corydalis decumbens(Thunb.)Pers.的干燥块茎。其性苦、微辛，温，归肝经，用于卒中偏瘫、头痛、跌扑损伤、风湿痹痛、腰腿疼痛[1]。现代药理学研究表明，夏天无具有抗炎、镇痛、降压、抗心律失常、保护脑神经、抗脑梗死、抗血小板聚集、抗血栓、兴奋平滑肌、抗胆碱酯酶等作用[2-6]。研究表明，夏天无主要活性成分为生物碱类，其中原阿片碱、巴马汀、延胡索乙素及荷包牡丹碱等含量较高[7-11]。现多采用HPLC法测定延胡索中原阿片碱、盐酸巴马汀和延胡索乙素的含量[12]。

化学成分是药效物质发挥作用的基础，传统中药的质量与其有效成分密切相关。中药化学成分繁多，因此选择指纹图谱结合多指标含量测定能够更好地控制中药质量的一致性和优劣评价。夏天无现行标准收载于《中国药典》2015年版一部，包括性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱鉴别及原阿片碱、盐酸巴马汀的含量测定[1]。现行质量标准存在着质控指标单一等问题，为了更合理地评价药材质量，本实验收集了15批夏天无药材，建立了其HPLC指纹图谱，在前期化学成分、现代药理研究及质量标志物预测分析的基础上，测定原阿片碱、黄藤素、荷包牡丹碱及延胡索乙素4种有效成分的含量。所建立的方法专属性强，可同时从定性、定量两方面来控制夏天无药材质量，更加全面地建立了夏天无的质量控制体系。

1仪器与材料

Agilent1260高效液相色谱仪，美国Agilent公司；Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色谱柱，美国Dikma公司；AB204-N电子天平（十万分之一），德国Meteler公司；BT25S电子天平（万分之一），德国Sartorius公司；超声波清洗仪，宁波新芝生物科技公司。

原阿片碱（批号MUST-17032408）、荷包牡丹碱（批号MUST-16070212）均购自成都曼思特生物科技有限公司；黄藤素（批号J140303）、延胡索乙素（批号J140303）均购自上海将来试剂有限公司，质量分数均大于98%。乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、乙醇（分析纯）、冰乙酸（分析纯），天津市康科德科技有限公司；三乙胺（分析纯），天津光复精密化工研究所；纯净水，广州屈臣氏有限公司。15批夏天无药材产地与批号见表1，药材均由天津饮片厂制药有限公司提供，经天津药物研究院中药现代研究部张铁军研究员鉴定为罂粟科植物伏生紫堇Corydalis decumbens(Thunb.)Pers.的干燥块茎，符合《中国药典》2015年版一部的有关规定。

2方法与结果

2.1混合对照品溶液制备

取原阿片碱、荷包牡丹碱、黄藤素、延胡索乙素对照品适量，精密称定，加甲醇制成含原阿片碱60.6μg/mL、黄藤素24.8μg/mL、荷包牡丹碱39.8μg/mL、延胡索乙素88.8μg/mL的混合对照品溶液，摇匀，即得。

2.2供试品溶液制备

取夏天无药材粉末（过40目筛）约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，浸泡30 min，超声处理60 min，放至室温，用70%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3色谱条件

色谱柱为DiamonsilC18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈-0.2%冰醋酸溶液（三乙胺调pH 6.0），梯度洗脱：0～10 min，13%～15%乙腈；10～15 min，15%～25%乙腈；15～32 min，25%～29%乙腈；32～35 min，29%乙腈；35～60 min，29%～62%乙腈；60～65 min，62%～90%乙腈；体积流量1.0 mL/min；柱温35℃；进样量10μL；检测波长280nm；理论塔板数按原阿片碱峰计算不低于3 000。

2.4指纹图谱的方法学考察

2.4.1精密度试验取批号为2017042005夏天无药材粉末（S4），按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3”项下色谱条件测定，连续进样6次，记录指纹图谱，以10号峰（延胡索乙素）的保留时间和色谱峰面积为参照，计算出各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。各色谱峰的相对保留时间及峰面积的RSD值均小于3%。

2.4.2稳定性试验取精密度试验项下同一供试品溶液（S4），按照“2.3”项下色谱条件，分别在0、3、6、9、12、24 h时测定，记录指纹图谱，以10号峰（延胡索乙素）的保留时间和色谱峰面积为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值均小于3%。

2.4.3重复性试验取同一批次夏天无药材（S4）粉末6份，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3”项下色谱条件测定，记录指纹图谱，以10号峰（延胡索乙素）的保留时间和色谱峰面积为参照，计算出各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值均小于3%。

2.5指纹图谱的建立

2.5.1指纹图谱的建立及相似度评价取15批夏天无药材，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定，得到15批夏天无指纹图谱（图1），将得到的数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012A版进行分析，以S1为参照指纹图谱，采用多点校正后进行自动匹配，生成对照指纹图谱，并对色谱峰进行指认（图2）。将15批夏天无供试品色谱图与对照指纹图谱匹配，进行相似度评价。

2.5.2聚类分析在“2.5.1”项条件下，以S1作为参照图谱自动匹配，运用SPSS 21.0数据统计分析软件对其进行系统聚类分析，利用平方欧氏距离作为样品的测度，采用组间联接法进行聚类，聚类结果见图3。结果显示，15批夏天无药材分为2类，其中产自江西的10批夏天无药材（S1～4、S 10～15）聚为一类，其余5批产自河南的夏天无（S5～9）聚为一类。

2.5.3主成分分析（PCA）为了评价所有成分的样品分辨能力，运用SIMCA-P 12.0分析软件对其进行主成分分析，结果见图4。由PCA图可以看出：产自江西的10批夏天无药材（药材S1～4、S10～15）整体聚为一类，其余5批（药材S5～9）聚为一类，与聚类分析结果一致。

2.6多指标成分测定

2.6.1混合对照品溶液制备同“2.1”项下混合对照品溶液的制备方法。

2.6.2供试品溶液制备取夏天无药材粉末（过40目筛）约1.0 g，精密称定，置100 mL圆底烧瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，回流提取60 min，放至室温，用70%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.6.3色谱条件色谱柱为DiamonsilC18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈-0.2%冰醋酸溶液（三乙胺调pH 6.0），梯度洗脱：0～10 min，13%～15%乙腈；10～15 min，24%乙腈；15～25 min，24%～30%乙腈；25～45 min，30%～65%乙腈；45～50 min，65%～100%乙腈；体积流量1.0mL/min；柱温35℃；进样量10μL；检测波长280 nm；结果各成分色谱峰与相邻峰的分离度均大于1.5，理论塔板数按原阿片碱峰计算不低于3 000。对照品和供试品色谱图见图5。

2.6.4线性关系考察精密吸取混合对照品溶液，制成6个不同质量浓度的对照品溶液，按照“2.6.3”项下色谱条件进行测定，并记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），对照品质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，并进行线性回归，得标准曲线方程。4个成分的线性回归方程见表3。

2.6.5精密度试验取同一批夏天无药材粉末（S4），按“2.6.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.6.3”项下色谱条件进行测定，连续进样6次，记录峰面积。计算原阿片碱、黄藤素、荷包牡丹碱和延胡索乙素峰面积RSD值分别为0.176%、0.169%、0.210%、0.957%，表明仪器精密度良好。

2.6.6稳定性试验取精密度试验项下同一供试品溶液，按照“2.6.3”项下色谱条件，分别在0、3、6、9、12、24 h测定，记录峰面积。计算原阿片碱、黄藤素、荷包牡丹碱和延胡索乙素峰面积RSD值分别为0.212%、0.487%、0.794%、0.998%，表明供试品溶液在室温放置24 h内稳定性良好。

2.6.7重复性试验取同一批次夏天无药材（S4）粉末6份，按照“2.6.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.6.3”项下色谱条件测定，记录峰面积。计算原阿片碱、黄藤素、荷包牡丹碱和延胡索乙素质量分数的RSD值分别为1.611%、1.414%、1.323%、1.303%，表明本法重复性良好。

2.6.8加样回收率试验取同一批次夏天无药材（S4）粉末6份，每份约0.5 g，精密称定，分别按已知含量的50%加入原阿片碱、黄藤素、荷包牡丹碱及延胡索乙素对照品，按照“2.6.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.6.3”项下色谱条件测定，记录峰面积。计算原阿片碱、黄藤素、荷包牡丹碱和延胡索乙素平均加样回收率分别为97.12%、100.09%、98.53%、99.71%，RSD值分别为0.97%、0.67%、1.61%、1.99%。

2.6.9样品测定分别取15批夏天无药材粉末，按照“2.6.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.6.3”项下色谱条件测定，计算样品中原阿片碱、黄藤素、荷包牡丹碱和延胡索乙素4个成分的量，结果见表4，各指标成分含量累积加和图见图6。

3讨论

3.1提取溶剂的考察

平行取4份夏天无药材粉末约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入90%甲醇、70%甲醇、50%甲醇和70%乙醇各50 mL，称定质量，浸泡30 min，超声处理60 min，放至室温，再用90%甲醇、70%甲醇、50%甲醇和70%乙醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，所得4份供试品溶液用HPLC进行测定，结果显示70%甲醇对夏天无药材中各成分的提取效果最好，故选择70%甲醇作为提取溶剂。

3.2检测波长的选择

本实验使用DAD检测器分别对夏天无对照品及供试品溶液进行200～400 nm全波长扫描，结果夏天无生物碱类成分在280 nm处有较大吸收，样品色谱图在280 nm处峰个数较多，各峰分离良好，特征峰明显且峰形较好，故选择280 nm作为测定波长。

3.3流动相的选择

本实验综合考虑基线、峰个数、各色谱峰分离度的影响，最终确定流动相为乙腈-0.2%冰醋酸溶液（三乙胺调pH 6.0）。夏天无生物碱类成分对流动相pH值的要求较高，因此应注意流动相pH值的稳定性。

本实验建立了夏天无药材HPLC指纹图谱的质量评价方法，通过相似度评价系统、聚类分析和主成分分析建立夏天无药材对照指纹图谱共有模式。采用HPLC法测定夏天无药材中原阿片碱、黄藤素、荷包牡丹碱及延胡索乙素4个成分含量的方法，方法简便、准确，重复性好。对15批夏天无药材4个指标成分进行了含量测定，结果表明各批次样品间原阿片碱、黄藤素、荷包牡丹碱及延胡索乙素含量无显著差异。本研究建立的夏天无药材指纹图谱结合多指标成分测定的方法可为夏天无药材的质量评价提供依据。